Choroby przenoszone przez żywność obejmują dość szeroki zakres i są wywoływane przez czynniki dostające się do organizmu wraz z tym, co jemy i pijemy. Światowa Organizacja Zdrowia stwierdza, że skażenie żywności może wystąpić na każdym etapie od procesu przetwórstwa do konsumpcji – „od pola do stołu”. Problem ten dotyczy zarówno krajów rozwiniętych, jak i rozwijających się. W wielu wypadkach ogniska patogenów związane są z biofilmami.
Biofilmy stały się problemem w wielu branżach przemysłu spożywczego, takich jak przetwórstwo drobiu, przetwórstwo mięsa, przetwórstwo mleka, przetwórstwo ryb i owoców morza czy browarnictwo.
Kilka słów o biofilmie
Biofilmy to zagregowana zbiorowość drobnoustrojów zgromadzona na styku dwóch faz. Na formowanie i rozwój biofilmu wpływa wiele czynników, w tym: specyficzny szczep bakterii, właściwości powierzchni materiału, parametry środowiskowe, dostępność składników odżywczych czy temperatura. Biofilm jest znacznie bardziej odporny nawet do 1000 razy na działanie środków biobójczych niż pojedyncze komórki, ponieważ w ramach biofilmu dysponują one barierą, która zmniejsza, a czasem wręcz zapobiega kontaktowi ze środkiem dezynfekcyjnym. Kolonizacja rożnych powierzchni przez mikroorganizmy możliwa jest dzięki ich adhezyjnym właściwościom, a strukturę powstałego biofilmu stabilizują zewnątrzkomórkowe substancje polimeryczne, tzw. EPS (extracellular polymeric substances). W skład EPS wchodzą polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe, surfaktanty, lipidy oraz woda, natomiast największą frakcję stanowią polisacharydy.
Biofilm jest dla drobnoustrojów znakomitą strategią przetrwania, którą dostępnymi narzędziami trzeba przełamać. Wiele rodzajów mikroorganizmów, także te, które powodują psucie się żywności oraz patogeny mogą tworzyć biofilm i odgrywać wręcz kluczową rolę w jego tworzeniu. W skład tego złożonego z wielu komórek organizmu mogą wchodzić drobnoustroje jednego lub wielu gatunków czy rodzajów. Właściwości powierzchni odgrywają ważną rolę w tworzeniu biofilmu. Może się on wytworzyć praktycznie na każdej powierzchni, w tym na metalu, szkle, tworzywie sztucznym, drewnie czy produkcie spożywczym. Czynnikami istotnymi są: faktura powierzchni (szorstka lub gładka), ładunek powierzchniowy, hydrofobowość, temperatura, obecność składników odżywczych. Salmonella i Listeria mogą przyłączać się w większej ilości do powierzchni hydrofobowych w odróżnieniu do powierzchni hydrofilowych. Wcześniej istniejący na powierzchni EPS ułatwia przyczepność kolejnym komórkom drobnoustrojów.
Biofilm wyposażony jest w sieć kanałów, którymi następuje zaopatrzenie w składniki odżywcze oraz usuwanie produktów przemiany materii. Kanały rozdzielają poszczególne kolonie. System kanałów umożliwia normalne funkcjonowanie komórkom znajdującym się w zewnętrznej warstwie mikrokolonii. Ich aktywność prowadzi do wzrostu grubości biofilmu. Komórki umieszczone w głębszych warstwach biofilmu mają zwolniony metabolizm lub wręcz przechodzą w stan anabiozy.
Komórki wbudowane w biofilm wykazują często odmienne właściwości od komórek żyjących pojedynczo i przejmują różne funkcje w biofilmie w zależności od zapotrzebowania. Architektura biofilmu chroni wchodzące w jego skład drobnoustroje przed czynnikami zewnętrznymi, w tym przed substancjami biobójczymi oraz pozwala na lepszą dostępność do składników odżywczych.
Istotną rolę w formowaniu i funkcjonowaniu biofilmu odgrywa międzykomórkowa sygnalizacja, znana jako zjawisko „quorum sensing” – QS. Polega ona na wytwarzaniu przez mikroorganizmy sygnałów chemicznych zwanych autoinduktorami, których stężenie wzrasta wraz z liczebnością kolonii bakterii. Możliwość porozumienia się komórek wewnątrz struktury biofilmu, pozwala na określenie biofilmu jako prymitywnego organizmu wielokomórkowego.
Etapy rozwoju biofilmu
Tworzenie biofilmu nie jest natychmiastowe i składa się z kilku etapów:
a) adhezja odwracalna
Początkowe przywiązanie bakterii może być aktywne lub pasywne, w zależności od ich ruchliwości. Komórki przylegające zapoczątkowujące tworzenie biofilmu posiadają tylko niewielką ilość EPS i wiele z nich jest zdolnych do samodzielnego poruszania się. Na tym etapie, który może się rozpocząć w zależności od warunków zewnętrznych w ciągu godziny, przyczepność jest odwracalna, ponieważ przyczepiona komórka nie jest zaangażowana w istotne zmiany morfologiczne prowadzące do tworzenia trwałego biofilmu. Standardowe użycie środków chemicznych eliminuje fazę początkową biofilmu.
b) adhezja nieodwracalna
Przekształcenie adhezji odwracalnej na nieodwracalną jest zmianą od słabej interakcji bakterii z powierzchnią do trwałego wiązanie w obecności EPS. Po powstaniu adhezji nieodwracalnej do usunięcia biofilmu konieczna jest silna siła ścinająca lub rozbicie przyczepności przez detergenty, enzymy, środki biobójcze, temperaturę przy czym w wielu przypadkach konieczne jest zastosowanie kilku czynników jednocześnie, aby uzyskać efekt synergii.
c) tworzenie mikrokolonii, rozwój architektury biofilmu
Powstawanie mikrokolonii jest wynikiem jednoczesnej akumulacji i wzrostu drobnoustrojów i jest związany z produkcją EPS, co pomaga wzmocnić wiązanie bakterii z podłożem i pomaga w stabilizacji kolonii przed jakimkolwiek stresem środowiskowym.
d) dojrzewanie
Dojrzewanie biofilmu to etap, w którym rozwija się on w zorganizowaną konstrukcję, która może być płaska lub w kształcie grzybka, w zależności od działających na strukturę sił oraz źródła składników odżywczych, od którego jest zależny. Postać grzybka tworzy się przy niskim oddziaływaniu sił ścinających natomiast przy dużej sile ścinającej, jak w przypadku układów produkcyjnych w obiegu biofilm przybiera strukturę płaską. Aby osiągnąć strukturalną dojrzałości wymagane są okresy co najmniej 10 dni.
e) dyspersja
Dyspersja jest ostatnim etapem cyklu tworzenia biofilmu i to umożliwia komórkom powrót do formy planktonowej. Zaburzenia zewnętrzne, takie jak zwiększone ścinanie płynu, wewnętrzne procesy biofilmu, takie jak endogenna enzymatyczna degradacja, uwolnienie EPS lub białka wiążącego powierzchnię, mogą być przyczynami odwarstwienia biofilmu. Oderwanie wydaje się być aktywnym procesem pozwalającym na kolonizację nowych nisz. Ponadto głód jest również uważany za powód oderwania i umożliwia bakteriom poszukiwanie bogatego w składniki odżywcze środowiska.
W ostatnim etapie rozwoju biofilm osiąga tzw. krytyczną grubość i stopniowo przestaje utrzymywać istniejącą formę. Następuje wówczas migracja komórek z peryferyjnych części dojrzałego biofilmu do otoczenia. Prawdopodobnie dochodzi do degradacji polimerowej matrycy, aktywacji aparatów ruchowych i zmian fizjologicznych w komórkach, umożliwiających ich egzystencję poza biofilmem. Przypuszcza się także, że odłączanie komórek od biofilmu i jego dyspersja jest celową separacją wynikającą z reakcji na niesprzyjające zmiany środowiskowe. Przyczyną tego zjawiska może być wyczerpanie składników pokarmowych lub problemy z ich przepływu w obrębie biofilmu. W ten sposób biofilm przystosowuje się do zmian środowiskowych, a oderwane komórki rozpoczynają proces kolonizacji nowych powierzchni.
Strategia zapobiegania
Biofilmy są poważnym problemem w sektorze spożywczym, dlatego szalenie istotne jest zrozumienie ich rozwoju i rozprzestrzeniania się, a następnie zastosowanie odpowiednich środków zaradczych. Pierwszą i najważniejsza zasadą zapobiegania tworzeniu się biofilmu jest regularne czyszczenie i dezynfekcja, aby komórki drobnoustrojów nie przyczepiły się mocno do powierzchni, czyli nie nastąpiła adhezja nieodwracalna na powierzchniach styku.
Zaproponować można trzy różne strategie zapobiegania :
a) dezynfekcja „w czas”, przed powstaniem biofilmu,
b) dezynfekcja biofilmu w jego początkowej fazie za pomocą mocnych środków dezynfekcyjnych
c) hamowanie przyłączania się drobnoustrojów poprzez wybór materiały powierzchniowe, które nie sprzyjają przywiązaniu do podłoża
Korzystnym czynnikiem jest kondycjonowanie powierzchni styku. Po zastosowaniu środka powierzchniowo czynnego powierzchnia staje się bardziej hydrofilowa. Spadek hydrofobowości na powierzchniach powoduje spadek adhezji bakterii. Pokrycie powierzchni np. chlorkiem bezalkonium lub nanosrebrem hamuje adhezję bakterii.
Środki dezynfekcyjne
Powszechnie używane substancje biobójcze jak podchloryn sodu, kwas nadoctowy czy nadtlenek wodoru są dobrym narzędziem do zwalczania biofilmów.
Podchloryn sodu
Podchloryn sodu (NaClO) to związek chemiczny używany do wybielania lub dezynfekcji i jest powszechnie stosowany chociażby z uwagi na skuteczność i niską cenę. Niewątpliwym minusem podchlorynu sodu jest jego korozyjność, stąd należy stosować produkty, które posiadają w swoim składzie substancje antykorozyjne, np. DM CID SL. NaOCl to skuteczny środek dezynfekcyjny także do inaktywacji biofilmu. Wiadomo jednak, że wykazuje większą skuteczność w środowisku o niskim pH niż w środowisku alkalicznym. NaClO jest wskazanym środkiem biobójczym przeciwko biofilmom Staphylococcus aureus , Streptococcus spp., L.monocytogenes. Skuteczność NaClO wykazuje w eliminacji L. monocytogenes, Pseudomonas spp. i Staphylococcus spp.
Nadtlenek wodoru (H2O2)
H2O2 jest jednym z powszechnie stosowanych środków dezynfekcyjnych ze względu na jego wysoką zdolność utleniania opartą na produkcji wolnych rodników, które wpływają na macierz biofilmu i w konsekwencji okazuje się skuteczny w zwalczaniu biofilmów. Z punktu widzenia bezpieczeństwa wiadomo, że nadtlenek wodoru to bezpieczne rozwiązanie, które nie powoduje reakcji alergicznych. Może on być ponadto stosowany w relatywnie wysokim stężeniu bez negatywnego wpływu na jakość produktu. H2O2 okazuje się skuteczny w hamowaniu tworzenia biofilmu w stężenie 0,05% (500 mg/l). Potrafi całkowicie zlikwidować część biofilmów w stężeniu 5% podczas 15 minut ekspozycji. Tu warto zwrócić uwagę na produkt OXO CLEAN DES, który stanowi idealne uzupełnienie standardowych rozwiązań higienicznych.
Kwas nadoctowy
Kwas nadoctowy ma silny zapach i niskie pH (2,8), w ofercie CID LINES jest dostępny w stężeniach 5 i 15% (KENOCID 2100-5%, KENOCID 2100-15%). Jest używany do oczyszczania wody i jako środek dezynfekcyjny. To idealny środek przeciwdrobnoustrojowy ze względu na jego ekstremalną zdolność utleniania. Ponadto nie można go dezaktywować przez katalazę i peroksydazę, które degradują nadtlenek wodoru. Kwas nadoctowy również rozkłada się na bezpieczne i przyjazne dla środowiska pozostałości (kwas octowy, nadtlenek wodoru, woda), a na jego skuteczność nie mają wpływu pozostałości białka. Kwas nadoctowy może zredukować istotną część biofilmów Listeria monocytogenes na stali nierdzewnej oraz Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa w krótkim czasie kontaktu, ale niestety nie macierz biofilmu. Kompleks biofilmu należy wcześniej wyeliminować za pomocą innych środków chemicznych.
Warto zwrócić uwagę na mniej popularne na rynku, formy pianowe, np. KENOCID 2100-S 5%. Ta forma aplikacji produktu pozwala na dłuższy kontakt produktu z powierzchniami pionowymi i skośnymi, ale ma także aspekt wizualny. Operator widzi, gdzie produkt został nałożony, a gdzie nie.
Alternatywne metody usuwania biofilmów
Enzymy
Enzymy mogą być ważną alternatywą dla usuwania biofilmu w przemyśle spożywczym. EPS jest jednak matrycą heterogeniczną, w celu degradacji kompleksu stosuje się więc kombinację enzymów.
Skuteczność enzymów w usuwaniu biofilmu może się różnić w zależności od gatunków bakterii, a można ją również wzmocnić łącząc działanie enzymów ze środkami powierzchniowo czynnymi.
Skład strukturalny EPS różni się nawet między bakteriami tego samego gatunku, ze sposobem, w jaki zostały biofilmy sformułowane i ich sposobem działania, co powoduje, że enzymy nie zawsze są skuteczne.
Zarówno z tego powodu, jak i faktu, że enzymy nie należą do najtańszych substancji, rowiązanie te jest stosunkowo kosztowne dla użytkowników.
Mieszanina proteaz i amylaz jest dobrym rozwiązaniem do rozbicia struktury biofimu. Podczas gdy proteazy hydrolizują białka, amylazy łamią wiązanie węglowodanów związane z kompleksem.
Podobnie połączenie enzymów hydrolizujących polisacharydy i oksydoreduktazy można zalecić do usuwania biofilmu bakteryjnego, ze względu na szeroki zakres aktywności enzymów hydrolizujących polisacharydy, przez co wykazują one przydatność do degradacji matrycy biofilmów.
Metody powiązane niszczenia biofilmów
Metody powiązane to połączenie dwóch lub więcej różnych technik zwalczania biofilmu, które okazały się skuteczne zastosowane, osobno jednak w celu uzyskania korzystniejszego efektu można zastosować kombinację metod.
Efekt synergii osiąga się przez połączenie dezynfekcji nadtlenkiem wodoru i działaniem UV oraz przy połączeniu dezynfekcji podchlorynem sodu i naświetlania UV. Skuteczność H2O2 można zwiększyć przez podwyższenie temperatury.
Aktywność przeciwdrobnoustrojowa i skuteczność wzrasta przy połączeniu podchlorynu sodu i nadtlenku wodoru.
Biodegradacja smarów i olejów
Omawiając kwestię biofilmów w przemyśle spożywczym warto wspomnieć o olejach i smarach, jako potencjalnym źródle powstawania tego groźnego zjawiska.
Oleje i smary są niezbędne dla prawidłowej pracy wielu urządzeń w przemyśle spożywczym.
W ich skład wchodzą w dużej części węglowodory o zróżnicowanych właściwościach fizyko-chemicznych. Przy kontakcie z wodą i drobnoustrojami na granicy faz olej-woda może dojść do powstania biofilmu. Niektóre mikroorganizmy wykształciły mechanizmy umożliwiające wykorzystanie węglowodorów do swojego odżywiania. Wytwarzane przez te mikroorganizmy biosurfaktanty znacznie zwiększają dostępność związków nierozpuszczalnych w wodzie, które następnie wykorzystują jako substrat do odżywiania.
Biodegradacja przez bakterie i grzyby smarów i olejów prowadzi do technicznych problemów z pracą urządzeń, maszyn przekładni i silników. Innym skutkiem biodegradacji olejów i smarów jest wytworzenia kwasów organicznych jako produktów rozpadu, które powodują korozję metali.
Podsumowanie
Zjawisko biofilmu, choć jest polem zainteresowania wielu naukowców nie zostało jeszcze do końca poznane. Biofilmy powodują wymierne straty w gospodarce. Przeciwdziałanie mikrobiologicznej degradacji materiałów polega głównie na zwalczaniu biofilmu za pomocą odpowiednich środków chemicznych lub stosowaniu nowych materiałów, trudnych do kolonizacji przez bakterie.
Eliminacja biofilmów jest szczególnie istotna z uwagi na zdrowie człowieka, dla którego może stanowić poważne zagrożenie. Szczególnie istotne jest poznanie mechanizmu powstawania oraz funkcjonowania biofilmu , aby w przyszłości opracować bardziej skuteczne, a zarazem mniej inwazyjne środki przeznaczone do jego eliminacji. Przy zwalczaniu biofilmów należy pamiętać, że oprócz unieszkodliwieniu mikroorgazmów należy także koniecznie usunąć resztki matrycy, aby nie stała się on inicjatorem kolejnej dojrzałej struktury biofilmu.
Materiały własne CID LINES Sp. z o.o.
W celu uzyskania szczegółowych informacji handlowych i rozwiązań technologicznych
w obszarach higieny w przemyśle spożywczym zapraszam do kontaktu:
Łukasz Kowalski
District Manager
L.Kowalski@cidlines.pl
tel. 60 77 88 009